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非洲猪瘟的实验室诊断

实验室资讯网时间:2019-02-21 点击: 百度搜索

【导读】由于非洲猪瘟缺乏预防用疫苗,为防止疫病的传播,就需要实施严格的卫生和生物安全控制措施,而这就依赖于疫病的快速、可靠的早期诊断。ASF 的诊断是指确诊动物正在感染,或者曾经感染过ASFV。因此,适用的诊断技术包括检测和识别ASFV特异性抗原、DNA或抗体的技术,所获取的检测信息也是控制和根......
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由于非洲猪瘟缺乏预防用疫苗,为防止疫病的传播,就需要实施严格的卫生和生物安全控制措施,而这就依赖于疫病的快速、可靠的早期诊断。ASF 的诊断是指确诊动物正在感染,或者曾经感染过ASFV。因此,适用的诊断技术包括检测和识别ASFV特异性抗原、DNA或抗体的技术,所获取的检测信息也是控制和根除计划的重要保障。在选择诊断技术时,分析疫病感染期非常重要(图1)。由于感染动物所处的感染期不同,因此在疫情和控制根除计划中,需要同时检测病毒和抗体以确保准确性

根据报道,ASF 的自然感染潜伏期为4~19天。在临床症状出现的两天前,ASF感染动物开始散播大量病毒。病毒散播因所感染的ASFV毒株毒力不同而异。感染后约7-9天血清转阳,抗体阳性可持续终生(图1)。

非洲猪瘟的实验室诊断

图1

病原学检测为阳性(即抗原)则表明,所检测的动物在取样时正在发生感染。而抗体检测阳性则表明感染正在或者已经发生,包括感染后已经恢复的动物(且可能终身保持血清阳性)。

自2015年底以来,东欧血清学流行病学调查数据显示血清学阳性动物的检出率显著增加,特别是在发生疫情的欧盟国家的野猪群体中尤为明显。这些结果表明,ASF感染耐过动物可存活超过一一个月并可能出现亚临宋感染的病例,就像在伊比利亚半岛、美洲和非洲之前所描述的情况。因此,抗体检测技术对于实施控制和根除计划所需的完整信息而言是必要的。

非洲猪瘟病毒检测

应用聚合酶链式反应(PCR)检测非洲猪瘟病毒基因组

PCR已成功应用于猪样品(血液、器官等)和蜱中ASFV基因组的检测。病毒DNA片段通过PCR扩增获得足以检测的量,从而实现检测。所有经过验证的PCR技术均可以在临床症状出现前实现检测。PCR能在样品到达实验室数小时内,完成ASF的诊断。PCR是可以代替病毒分离鉴定的一种灵敏、特异、快速的ASFV检测技术。同时,相比于抗原检测技术,如酶联免疫吸附试验(ELISA)和直接荧光抗体测试(FAT) ,具有更高的敏感性和特异性。需要注意的是,PCR的高度敏感性使其容易发生交叉污染,应该采取适当的预防措施来减少和控制污染风险的发生。

OlE在《陆生动物诊断试验和疫苗手册》(2016 年)中推荐使用的常规和实时荧光PCR得到了长期的充分验证,是常规诊断的重要工具。此外,除了OIlE推荐的适用于康复动物ASF基因组检测的实时荧光PCR技术外,其他研究者建立的实时荧光PCR已经证实更为敏感。在这些分子技术中使用的引物和探针多以VP72编码区域作为靶基因设计,该基因片段是ASFV基因组中研究清楚,且高度保守的区域。应用这些PCR技术,即使在灭活或降解的样品中也可检测到已知所有22种p72病毒基因型的多个毒株。

对于特急性、急性或亚急性ASF感染病例,PCR 是首选的检测技术。此外,由于PCR检测病毒基因组,即使病毒分离鉴定为阴性的、含有无感染性病毒粒子的样品,也可完成检测,这也使其成为用于检测感染低或中等毒力毒株的重要工具。虽然聚合酶链式反应(PCR)不能提供病毒感染性的信息,但可以提供定量的信息。

非洲猪瘟病毒分离

病毒分离是将样品接种易感的猪源原代细胞、单核细胞和巨噬细胞而进行的检测。如果在样品中存在ASFV,则会在易感细胞中复制,在感染细胞中产生细胞病变(CPE)。细胞裂解和细胞病变(CPE)通常在出现红细胞吸附现象的48-72小时后发生。ASFV的红细胞吸附试验是该病毒特有的检测技术,其他猪源病毒在白细胞培养物中不存在红细胞吸附特性。当病毒在这些培养物中复制时,多数ASFV毒株会产生红细胞吸附反应(HAD),在感染的白细胞周围吸附猪红细胞形成“玫瑰花环”(图2)。

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图2

此外, 需要说明的是,在没有发生红细胞吸附反应的时候出现CPE, 可能是由于接种物的细胞毒性所致,或者由于其他病毒如伪狂犬病毒的感染,或者由于不产生红细胞吸附反应的ASFV毒株导致。 旦发生这类情况,必须采用其他的病毒学检测技术如FAT或PCR,检测细胞沉淀物是否存在ASFV。而如果细胞分离没有观察到任何变化,或者FAT和PCR检测为阴性,则需要将细胞培养上清-再次接种新的培养物种,连续传代3-5代,之后方可确认为ASFV阴性。

对于抗原检测(ELISA、 PCR或FAT)为阳性的样品,推荐HAD为完成病毒分离和鉴定的参考试验。而如果通过其他方法已经证实ASF感染,特别是在首次暴发ASF的地区,也建议使用红细胞吸附试验鉴定病毒。此外,病毒分离对于进一步的分子生物学研究也是必要的基础。

直接荧光抗体法对非洲猪瘟抗原的检测

FAT可用于检测猪组织中的ASFV抗原。检测原理是通过显微观察感染脏器涂片或薄层冷冻切片,上的病毒抗原实现的。使用异硫氰酸荧光素(FITC) 结合的特异性抗体检测细胞内抗原。FAT 也可用于检测未观察到HAD的白细胞培养物中的ASFV抗原,因此可以鉴定不产生HAD反应的ASFV毒株。FAT 还可用于鉴别CPE是由ASFV感染导致的,还是由其他病毒感染或者导致的接种的细胞毒性导致的。

阴阳性对照是保证切片被正确判定的重要保障。该方法也是对特急性和急性ASF病例的高度敏感的检测技术,且可以非常快速的完成检测。虽然FAT 是高效的检测技术,但目前已被PCR逐步取代,所需试剂也不再广泛使用。然而值得一提的是,在亚急性和慢性型感染中,FAT 的敏感性明显降低(40%)。

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ELISA对非洲猪瘟抗原的检测

也可以使用EUISA检测病毒抗原,其成本比PCR更为低廉,并且可在没有特殊的实验室仪器设备的条件下,短时间内对样品的大规模筛查,然而,与FAT相似, 对于亚急性和慢性病例,抗原ELISA的敏感性明显较低。同时,现地样品通常状态不佳,因此也降低了检测的敏感性。因此建议抗原ELISA (或其他ELISA)主要用于“群体”检测,并辅助以其他病毒学和血清学检测。

非洲猪瘟抗体检测

血清学检测技术因其简便、低成本和无需特殊的仪器设备,而成为最常用的检测技术。由于ASF尚没有可用的疫苗,ASFV 抗体阳性即表明当前或者曾经发生了感染。此外,ASFV抗体在感染早期即可出现,并持续数年。然而,在特急性和急性感染中,猪通常在抗体转为阳性前已死亡。因此,在疫病暴发的早期阶段,建议采集样品检测病毒DNA。

对于检测ASF抗体,推荐使用ELISA筛查抗体阳性样品, 并采取免疫印迹试验(IB) 或间接荧光抗体(FA)试验进行确认。此外,间接免疫过氧化物酶的抗体检测技术也可用作猪血清和组织渗出物中ASF抗体检测的替代试验。该技术也适,用于大量样品的检测,而无需昂贵的荧光显微镜设备,且敏感性较高。

ELISA对非洲猪瘟抗体的检测

ELISA是一种常用的检测技术,广泛用于多种动物疫病的大规模血清学调查。该方法的显著特点是灵敏度高、特异性好、速度快、成本低,结果清晰。借助于自动化设备的使用,可以实现大量样品的快速筛选。

ELISA使用标记物检测血清样品中的ASF抗体。ELISA使用的标记通常是某种酶。当抗原和抗体彼此结合时,酶引起底物发生颜色变化,从而鉴定ASF阳性样品。目前,多种用于ASF抗体检测的间接或阻断ELISA已实现商品化供应,或者由实验室“自主”建立。

血清处理或保存不当(储存或运输不当),如溶血样品可能会产生高达20%的假阳性结果。因此,通过ELISA检测的所有阳性和可疑样品必须通过其他血清学替代试验确认。

免疫印迹试验(IB)技术是用于蛋白质检测和鉴定的快速、灵敏的检测技术。IB技术的原理是抗原抗体的特异性结合。IB 技术中使用了覆盖有病毒抗原的纸条,首先是抗原溶解、电泳分离、以及转移到薄膜上(通常是硝化纤维索膜),之后与特异性一抗反应,再与标记二抗作用后,产生可直接观察的阳性反应条带。

非洲猪瘟的实验室诊断

ASFV感染后首先刺激机体产生抗体的多种病毒蛋白,通过在IB试验,可在所有感染动物中标定地检测到。动物感染后7-9天血清转阳,并可在康复动物体内存在几个月。接种其他病毒疫苗的动物血清,可能会产生非特异性反应,因此需要借助于如IPT或者FAT等技术进行确认。

间接荧光抗体试验(IFA)对非洲猪瘟抗体的检测

该技术的原理是用具有细胞适应性的ASFV毒株,感染单层绿猴肾细胞,再通过特异性抗原抗体反应实现对ASF抗体的检测。抗原抗体反应通过耦联的荧光素进行检测。阳性样品在感染细胞的胞浆中出现特异性荧光。IFA 是一种快速、高度敏感和特异的ASF抗体检测技术,适用于血清、血浆或组织分泌物中抗体的检测。

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间接免疫过氧化物酶试验(IPT)对非洲猪瘟抗体的检测

免疫过氧化物酶试验(IPT)是一-种细胞免疫化学技术,细胞固定后通过耦联的过氧化物酶实现抗原抗体复合物的检测。在IPT反应过程中,绿猴肾细胞感染了适应于这些细胞的ASFV适应株。感染细胞首先被固定,之后用作抗原以确定样品是否存在针对ASF的特异性抗体。与FAT检测一样,IPT 是具有高度的敏感性和特异性的快速检测技术,适用于从血清、血浆或组织渗出液中检测ASF抗体。但因为采用了酶学显色系统,其结果判定比FAT更为简单。

非洲猪瘟的实验室诊断

综上所述, 目前可用的诊断技术可通过综合病毒和抗体检测来确诊ASF。实时荧光PCR是最广泛应用的病毒学诊断技术,可敏感、特异、快速的实现ASFV核酸的检测。

由于存在交叉污染的可能,来自无疫区的单个动物(例如野猪)的PCR阳性,或在一-群动物中出现的单个PCR阳性样品,应采取其他的病毒检测方法, 以及结合血清学、病理学和流行病学调查的结果综合确诊。由于PCR所检测到的阳性是病毒核酸阳性,而不是感染性病毒粒子,因此,在PCR之外,强烈推荐新的意思感染地区。在报告发生疫情前,先从感染样品中分离获得病毒以确认。

虽然经过验证的ELISA是检测ASF抗体的候选技术,特别是对血清样品的初步筛查,但应时刻注意检测的局限性。应使用其他的确证试验,如1B、 IFA 或IPT,以发现ELISA检测中的假阳性样品。此外,IFA 和IPT是组织渗出液和血浆样品检测的首选技术,因为他们能完整展示流行病学过程,并可确定感染的具体时间。

ASF准确的诊断必须包括病毒学和血清学检测结果,同时结合临床、病理和流行病学的调查结果。表5总结了ASF的主要实验室诊断技术及其特性。

非洲猪瘟的实验室诊断

(本文来源:FAO-非洲猪瘟:发现与诊断 )

(责任编辑:大林)

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